Welcome to JUNblood! Development of innovative diagnostic tools for the detection and characterization of circulating tumor cells (CTCs) in patients' blood

Τη τελευταία δεκαετία η διάγνωση του καρκίνου γίνεται ολοένα και πιο ευέλικτη χρησιμοποιώντας την υγρή βιοψία. Η υγρή βιοψία αποτελεί επανάσταση στην πρόγνωση και θεραπευτική του καρκίνου, και έχει ως ακρογωνιαία λίθο τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα. Τα ΚΚΚ σε σχέση με τα υπόλοιπα στοιχεία της υγρής βιοψίας (κυκλοφορούν καρκινικό DNA, microRNAs, εξωσώματα) μπορούν να δώσουν σημαντικές πληροφορίες για την βιολογία του καρκινικού κυττάρου, καθώς και τις αλλαγές που πραγματοποιούνται με την πάροδο του χρόνου ή υπό την πίεση της θεραπείας. 

Πρόκειται για κύτταρα που εξέρχονται του πρωτοπαθούς όγκου πολύ νωρίς κατά την ογκογένεση, μπαίνουν μέσα στη λέμφο ή στα αγγεία και μεταναστεύουν σε άλλα όργανα, δημιουργώντας  μεταστάσεις οι οποίες είναι κυρίως υπεύθυνες για την κακή έκβαση της νόσου. Συνήθως ένα μεγάλο ποσοστό των ΚΚΚ είναι αποπτωτικά και έχουν πολύ περιορισμένη διάρκεια ζωής. Ωστόσο πολλά από αυτά διαθέτουν το δυναμικό να επιβιώσουν και να διαφύγουν από την κυκλοφορία του αίματος, να εγκατασταθούν εκ νέου σε έναν υγιή ιστό του σώματος, και να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα σχηματίζοντας μεταστάσεις. 

Η μεταστατική διασπορά των καρκινικών κυττάρων, και όχι ο πρωτοπαθής όγκος, είναι κυρίως υπεύθυνη για τον θάνατο των ασθενών με καρκίνο. Έτσι, η δυνατότητα ανίχνευσης αυτών των κυττάρων συνθέτει έναν από τους βασικούς σκοπούς της υγρής βιοψίας, αποτελώντας έναν καινοτόμο τρόπο διάγνωσης των μεταστάσεων σε ασθενείς με καρκίνο, ακόμα και πριν αυτές γίνουν κλινικά ανιχνεύσιμες. Μέχρι σήμερα τα KKK, παρόλο που η προγνωστική τους αξία έχει τεκμηριωθεί εδώ και πολλά χρόνια, δεν έχουν χρησιμοποιηθεί στην καθημερινή κλινική πρακτική διότι είναι σπάνια κύτταρα, ενώ τα ιδιαίτερα φαινοτυπικά και μοριακά χαρακτηριστικά τους τα καθιστούν δύσκολα ανιχνεύσιμα.

Πρόκειται για κύτταρα συνήθως σε επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (epithelial to mesenchymal transition, EMT). Η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα KKK χάνουν σταδιακά τον αμιγώς επιθηλιακό τους χαρακτήρα, αποκτώντας ταυτόχρονα ορισμένα μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, πληθώρα μελετών τα τελευταία χρόνια καταδεικνύουν ότι τα KKK πολλές φορές δεν εκφράζουν κυτταροκερατίνες αλλά μεσεγχυματικούς δείκτες όπως η βιμεντίνη, ενώ επιπλέον ένα μεγάλο ποσοστό αυτών των κυττάρων κατέχουν βλαστικά χαρακτηριστικά (cancer stem cells, CSCs). Είναι λοιπόν αδύνατο να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν με επιθηλιακούς δείκτες όπως οι Κυτταροκερατίνες ή το ΕpCAM που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα από συστήματα όπως το Cell Search (FDA approved). 

Από την άλλη πλευρά οι μεσεγχυματικοί δείκτες που έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα, όπως η βιμεντίνη, εκφράζονται σε πολύ μεγάλο ποσοστό στα κύτταρα του αίματος, καθιστώντας την διάκριση των ΚΚΚ αδύνατη μέσα στο δείγμα. Υπάρχει επομένως επείγουσα ανάγκη να βρεθούν νέοι βιοδείκτες που θα βοηθήσουν τον αποτελεσματικό χαρακτηρισμό των ΚΚΚ στο αίμα ασθενών με νεοπλασία.

Πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας σε ασθενείς με καρκίνο μαστού, ανέδειξαν ένα νέο συνδυασμό βιοδεικτών που μπορεί να χαρακτηρίσει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ. Συγκεκριμένα η συνδυασμένη ανίχνευση του υποδοχέα χημειοκίνης CXCR4 και του μεταγραφικού παράγοντα JUNB μπορεί να διακρίνει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών. Ποσοτικοποίηση δε της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών έδειξε πως τα κύτταρα του αίματος εκφράζουν πολύ χαμηλά ποσοστά του μεταγραφικού παράγοντα καθιστώντας το JUNB ένα πολύ καλό βιοδείκτη για την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων μέσα στο αίμα. Επιπλέον εντοπίστηκαν σε περισσότερους από τους μισούς ασθενείς κύτταρα αρνητικά για κυτταροκερατίνες, αλλά θετικά για JUNB με χαρακτηριστικά νεοπλασματικών κυττάρων (ΚΚΚ), υποδηλώνοντας πως το JUNΒ είναι αποτελεσματικότερος βιοδείκτης από τις κυτταροκερατίνες. Επιπροσθέτως, ασθενείς που είχαν JUNB-θετικά KKK στο αίμα τους είχαν κακή πρόγνωση.

Σε βιβλιογραφικές αναφορές τα μόρια αυτά έχουν σχετιστεί με την ύπαρξη ΕΜΤ φαινοτυπικών χαρακτηριστικών και με την μεταστατική διασπορά. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά συμπεραίνεται ότι τα JUNB και CXCR4 μπορούν να αποτελέσουν καινοτόμα διαγνωστικά μόρια/βιοδείκτες ανίχνευσης, καθώς και ενδεχόμενους μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους. Επιπρόσθετα, σε συνεργασία με το Πανεπιστημιακό νοσοκομείο του Essen στην Γερμανίας, εντοπίστηκε η ύπαρξη και η προγνωστική αξία διεσπαρμένων καρκινικών κύτταρων (disseminated tumor cells, DTCs) με έκφραση των CXCR4 και JUNΒ στο μυελό των οστών ασθενών με καρκίνο του μαστού. 

Τέλος σε άλλη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας έχει δειχθεί πως τα μόρια του ανοσιακού ελέγχου PD-1/PD-L1 εκφράζονται στα KKK ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, σε υψηλό ποσοστό, ενώ είναι γνωστό πως τα παραπάνω μόρια χρησιμοποιούνται ως βιοδείκτες για την ανοσοθεραπεία. Σύμφωνα με βιβλιογραφικές αναφορές το JUNΒ μπορεί να επάγει την έκφραση του PD-L1 και η διερεύνηση της ύπαρξης PD-L1 (+)/JUNB(+) KKK στο αίμα ασθενών με καρκίνο αποτελεί αντικείμενο εξαιρετικού ενδιαφέροντος.

Εν κατακλείδι, το σύνολο των παραπάνω ερευνητικών συμπερασμάτων, ώθησε την ερευνητική μας ομάδα στην περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης και της προγνωστικής αξίας των μορίων JUNB, CXCR4 και PD-L1 στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, προστάτη και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, του οποίου οι ασθενείς διαθέτουν μεγάλο αριθμό KKK.

Στόχοι λοιπόν του προτεινόμενου έργου είναι:

Α) Επιβεβαίωση σε μία προοπτική ομάδα μεταστατικών (validation group, n=100) ασθενών με καρκίνο μαστού της προγνωστικής αξίας  της έκφρασης του CXCR4 και JUNB στα ΚΚΚ.

Β) Διερεύνηση της υπερέκφρασης των CXCR4, και JUNB στα ΚΚΚ με μοριακές μεθόδους (Real Time PCR) στα ίδια δείγματα των ασθενών. Τα πειράματα αυτά θα δώσουν μια νέα πειραματική προσέγγιση δίνοντας μια συμπληρωματική πληροφορία για την πρόγνωση της νόσου.

Γ) Επέκταση της διερεύνησης της προγνωστικής αξίας των JUNB(+)/CXCR4(+) στα KKK σε άλλους τύπους καρκίνου όπως ο μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (SCLC), στον οποίο κατά κανόνα ανιχνεύεται μεγάλος αριθμός ΚΚΚ.

Δ) Διερεύνηση της προγνωστικής αξίας των CXCR4 και JUNB σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο προστάτη. Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένα πολύ διαδεδομένο νεόπλασμα σε άνδρες άνω των 50, ενώ διαθέτει ΚΚΚ τα οποία έχουν προγνωστική αξία για τους ασθενείς.

Ε) Μελέτη της συνέκφρασης και προγνωστικής αξίας των JUNB/PD-L1 στα ΚΚΚ δεδομένου ότι ο μεταγραφικός παράγοντας JUNΒ μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του PD-L1(11), ενώ οι θεραπείες έναντι του PD-1 και PD-L1 έχουν φέρει επανάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα. Επίσης πρόσφατες μελέτες της ομάδας μας έδειξαν πως τα PD-1/ PD-L1 εκφράζονται σε υψηλό ποσοστό στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

Ζ) Ανάπτυξη μεθοδολογίας ανίχνευσης του CXCR4, JUNB και PD-L1 στα ΚΚΚ ασθενών με SCLC με κυτταρομετρία ροής (FSCS). Επομένως η συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών στα ΚΚΚ μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την πρόγνωση αυτών των ασθενών αλλά και την χορήγηση στοχευμένων θεραπειών.

Η) Τυποποίηση διαγνωστικών τεστ από την εταιρία Ζαφειρόπουλος για την ανίχνευση JUNB-CXCR4-θετικών ΚΚΚ καθώς και JUNB-PD-L1-θετικών ΚΚΚ στο αίμα ασθενών με καρκίνο.

Α) Ασθενείς που φέρουν ΚΚΚ με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά (JUNB, CXCR4) έχουν κακή πρόγνωση, επομένως διαθέτουν αυξημένη πιθανότητα για μεταστατική διασπορά. Για το λόγο αυτό θα πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά και ενδεχομένως να λάβουν μια πιο ενισχυμένη θεραπεία πρώτης γραμμής ή συμπληρωματική χημειοθεραπεία, εξειδικευμένη στη περίπτωσή τους.

Β) Εάν τα KKK εξακολουθούν να υπάρχουν μετά από το πέρας κάποιας θεραπείας σημαίνει ότι θα μπορούσε να εξεταστεί κάποια εναλλακτική θεραπεία που θα στοχεύσει καλύτερα την ενδεχόμενη δημιουργία μετάστασης.

Γ) Με δεδομένο ότι υπάρχουν εγκεκριμένες ανοσοθεραπείες για καρκίνο του πνεύμονα και του μαστού καθώς επίσης αναπτύσσονται στοχευμένες θεραπείες που αφορούν στο CXCR4 και JUNB θα μπορούσε το τεστ αυτό να αποτελέσει ένα διαγνωστικό τεστ για την χορήγηση των συγκεκριμένων θεραπειών στο μέλλον.

Δ) Τα αναπτυσσόμενα τεστ θα είναι ανώδυνα για τους ασθενείς, εύκολα εφαρμόσιμα στο εργαστήριο, χωρίς να απαιτούν εξειδικευμένες ακριβές υποδομές, σε αντίθεση με τη κλασσική μέθοδο διάγνωσης της στερεής βιοψίας.